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饥饿激素对胃癌细胞转移的影响

 论文栏目:癌细胞论文     更新时间:2018/6/13 11:14:40   

[摘要]目的探讨饥饿激素在胃癌细胞转移中的作用及其机制。方法将胃癌MKN-28细胞分为空白对照(normalcontrol,NC)组、ghrelin组及Akt阻断剂组3组。Ghrelin组采用10-8M饥饿激素处理MKN-28细胞;Akt阻断剂组在ghrelin组基础上添加Akt阻断剂哌立福新(perifosine)5M。采用划痕法与Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力;Westernblot法检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen,PTEN)、磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylatedproteinkinaseB,p-Akt)及肌动蛋白的表达变化。结果Ghrelin组细胞迁移和侵袭能力均高于NC组(P<0.05),Westernblot结果显示ghrelin组p-Akt与PI3K表达升高,PTEN表达下调,这种作用被哌立福新部分阻断。结论饥饿激素可以促进胃癌细胞迁移和侵袭,p-Akt/PI3K表达上调和PTEN下调可能是饥饿激素作用的分子机制。

[关键词]胃肿瘤;饥饿激素;磷脂酰肌醇三激酶

我国的癌症病死率高达68.01%,胃癌是最常见的恶性肿瘤之一[1]。影响胃癌生存期的因素很多,而浸润和转移是导致胃癌患者死亡的最主要原因。饥饿激素(ghrelin)是1999年日本科学家Kojima从大鼠胃内提取的一种肽,主要由胃底泌酸腺合成,并少量表达于心、脑、胰腺与脂肪组织等部位[2]。多项有关肿瘤细胞的研究表明,饥饿激素可以促进肿瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进癌细胞的运动和侵袭[3-6]。课题组前期研究发现,饥饿激素在胃癌细胞的增生中起着重要作用,但分子机制仍待进一步阐明[7]。因此,本研究旨在对饥饿激素在胃癌细胞转移中的作用机制做初步探讨。

1材料与方法

1.1试验耗材

超敏型ECL检测试剂盒购自凯基生物公司,乙酰化饥饿激素(纯度>99%)购自以色列ProSpec公司,Akt阻断剂哌立福新购自美国SelleckChemicals公司,肌动蛋白(Actin)抗体购自碧云天生物技术研究所。

1.2研究方法

1.2.1细胞培养和处理人胃癌高转移MKN-28细胞购自凯基生物公司。用含10%胎牛血清的F12培养基于37℃、CO2体积分数为0.05的细胞培养箱中培养。4~6d传代1次,取对数成长期细胞进行试验。将MKN-28细胞分为ghrelin组、Akt阻断剂组及空白对照(normalcontrol,NC)组。Ghrelin组用10-8M饥饿激素处理MKN-28细胞;Akt阻断剂组在10-8M饥饿激素处理30min后添加5MAkt阻断剂哌立福新,与细胞共孵育24h。1.2.2蛋白质印迹法取对数生长期胃癌MKN-28细胞,将提取的蛋白通过SDS-PAGE电泳后,电转至硝酸纤维素膜上。封闭2h后,加入一抗(美国CST公司),人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromo-someten,PTEN)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylatedproteinkinaseB,p-Akt)、肌动蛋白(1:1000)、磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)(1:500),4℃孵育过夜。二抗(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)孵育1h,缓冲液再清洗后,超敏型ECL检测试剂盒(凯基生物公司)显色。实验重复3次,检测PTEN、PI3K、p-Akt及肌动蛋白的表达情况。1.2.3划痕实验取对数生长期胃癌MKN-28细胞,将处理好的细胞以每孔5×105个消化接种于六孔板,用10%胎牛血清的F12培养基培养,培养细胞达60%左右后用规格200L移液枪枪头在样本的细胞层划痕。磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,PBS)冲洗后换取新鲜培养液,置于37℃、CO2体积分数为0.05的细胞培养箱中培养24h,检测细胞迁移能力。1.2.4Transwell侵袭实验取对数生长期胃癌MKN-28细胞,先将Matrigel基质胶放置4℃过夜融化,在小室中加入处理好的细胞后,结晶紫染色成功后计算数量并记录(倍数×200),检测细胞侵袭能力。1.3学分析采用SPSS13.0软件进行分析,计数资料以频数表示,采用2检验;计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析,<0.05为差异有学意义。

2结果

2.1饥饿激素促进胃癌细胞迁移将10-8M饥饿激素处理胃癌MKN-28细胞24h后,通过划痕试验检测细胞迁移能力,发现ghrelin组较NC组划痕细胞间的长度缩短,提示细胞迁移能力升高,而Akt阻断剂哌立福新可以部分阻断该作用(<0.05)。见图1。2.2饥饿激素促进胃癌细胞侵袭将10-8M饥饿激素处理胃癌MKN-28细胞,ghrelin组侵袭细胞数较NC组增多,而Akt阻断剂可以部分阻断该作用(<0.05)。见图2。2.3饥饿激素通过PTEN/PI3K/Akt信号通路调节胃癌细胞转移Westernblot结果显示,ghrelin组较NC组PTEN表达下调,PI3K和p-Akt表达上调,而Akt阻断剂哌立福新部分拮抗该作用。见图3。

3讨论

目前,早期发现胃癌的能力和技术已不断提高,但高龄胃癌患者术后仍有较高死亡率与并发症[8]。已知饥饿激素是生长激素促分泌受体(growthhormonesecretagoguereceptor,GHSR)的配体[2],GHSR有2个已知的mRNA亚型,GHSR1a和GHSR1b。GHSR1a是一种366个氨基酸组成的七跨膜结构域蛋白,是由饥饿激素介导多种生理效应的功能受体[9]。有研究表明饥饿激素和GHSR1a在大肠癌组织和细胞系中均明显上调,下调GHSR1a后大肠癌细胞存活率明显降低[10]。随着癌症的发生率和死亡率居高不下,越来越多的学者开始关注饥饿激素与癌症,包括胃癌。Tian等[4]在胃癌细胞中的研究中发现,饥饿激素通过GHSR/NF-B信号通路上调胃癌细胞转移因子基质金属蛋白酶-2的表达,促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。本次研究进一步验证了这样的结果,通过划痕实验与Transwell实验检测胃癌细胞的迁移和侵袭能力,发现在ghrelin组中,无论细胞的迁移能力还是细胞的侵袭能力都增加,提示饥饿激素与胃癌的转移呈正相关。PI3K/Akt信号通路在肿瘤的发生和发展中起到至关重要的作用。PTEN是PI3K的主要拮抗剂,是该途径的负调节因子,亦是一种具有良好特征的肿瘤抑制因子[11]。通过蛋白质印迹法检测PTEN/PI3K/p-Akt蛋白的表达,结果显示ghrelin组Akt/PI3K表达上调和PTEN表达下调。运用Akt阻断剂处理后,发现Akt阻断剂哌立福新可以部分阻断该作用,提示饥饿激素可能通过PTEN/PI3K/Akt通路调节胃癌细胞转移。今后有望将饥饿激素与其受体调节剂应用于抗肿瘤治疗中,对于放化疗不敏感的胃癌患者可能又多了一个新的治疗靶点。在胃癌的发生和发展过程中,尤其是对于了解胃癌转移和预后情况,可以提供一个新的检测方法。

作者:李欢庆 樊晓明 单位:复旦大学附属金山医院消化内科

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