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细胞周期癌细胞论文

 论文栏目:癌细胞论文     更新时间:2015-4-22 14:48:15   

一、方法

1.细胞培养:HT-29细胞以含1%青霉素-链霉素混合液、10%胎牛血清的McCoy’s5A培养基培养于5%CO2、37℃饱和湿度的细胞培养箱中,常规消化传代,取对数生长期细胞进行实验。2.CCK-8法检测细胞增殖情况:取对数生长期细胞制成单细胞悬液,以1×104/孔接种于96孔板,于培养箱内孵育24h后,分别加入终浓度为0、10、20、30、40mmol/L的5-ASA溶液,每组设5个复孔,避光孵育24h后弃培养基,加入含10μg/LCCK-8的培养基避光孵育1.5h。以酶标仪测定450nm波长处各孔吸光度(A)值,计算细胞增殖抑制率,细胞增殖抑制率=[1-(对照组A值-处理组A值)/(对照组A值-本底A值)]×100%。3.TUNEL法检测细胞凋亡情况:取对数生长期细胞,以1×105/皿接种于直径3cm的培养皿,孵育24h后,分别加入终浓度为0、10、20、30、40mmol/L的5-ASA溶液,避光孵育24h后加入4%多聚甲醛溶液固定60min,3%H2O2甲醇溶液阻断10min,0.5%TritonX-100溶液通透15min,滴加TUNEL工作液孵育80min,二抗孵育30min,DAB显色,苏木精复染。阳性细胞为细胞核呈棕黑色颗粒的皱缩细胞,光学显微镜下随机选取3个视野(×400)计数阳性细胞,计算凋亡指数(apoptosisindex,AI),AI=(阳性细胞数/总细胞数)×100%。4.流式细胞术检测细胞周期:取对数生长期细胞,以8×105/孔接种于6孔板,孵育24h后,换用含3%胎牛血清的培养基培养24h(血清饥饿法)以调整细胞周期,分别加入终浓度为0、10、20、30、40mmol/L的5-ASA溶液,避光孵育24h后消化为单细胞悬液,加入A液固定10min后加入B液(RNaseA酶溶液)处理10min,最后加入C液(PI)染色30min后上机检测。5.免疫组化法检测AuroraB、BubR1蛋白表达:取对数生长期细胞,以1×105/皿接种于直径3cm的培养皿,孵育24h后,分别加入终浓度为0、10、20、30、40mmol/L的5-ASA溶液,避光孵育24h后加入4%多聚甲醛溶液固定60min,3%H2O2甲醇溶液阻断10min,0.5%TritonX-100溶液通透(AuroraB,20min;BubR1,10min),山羊血清封闭25min,加入AuroraB兔抗人多克隆抗体(1∶200)孵育90min、BubR1兔抗人多克隆抗体(1∶300)孵育60min,二抗孵育,DAB显色,苏木精复染。光学显微镜下随机选取3个视野(×200),测定各组平均光密度(MOD)值。

二、学分析

应用SPSS11.5软件,实验数据以x珋±s表示,多组间均数的比较采用单因素方差分析(方差齐)或Kruskal-WallisH检验(方差不齐),组间两两比较采用LSD法(方差齐)或Nemenyi法(方差不齐)。相关性的分析采用Pearson相关分析(正态分布)或Spearman秩相关(非正态分布)。P<0.05为差异有学意义。结果一、5-ASA对HT-29细胞增殖的影响CCK-8法检测结果显示,5-ASA10、20、30、40mmol/L组HT-29细胞增殖抑制率分别为(8.20±3.03)%、(14.03±2.41)%、(21.05±3.33)%和(25.59±3.90)%,随5-ASA浓度升高而升高,各组间差异均有学意义(P<0.05)。二、5-ASA对HT-29细胞凋亡的影响TUNEL法检测结果显示,5-ASA0、10、20、30、40mmol/L组HT-29细胞的AI分别为(0.27±0.38)%、(7.11±1.65)%、(7.87±1.28)%、(10.63±2.31)%和(14.82±2.93)%,随5-ASA浓度升高而升高,除10mmol/L组与20mmol/L组间外,各组间差异均有学意义(P<0.05)(图1)。

三、5-ASA对HT-29细胞周期的影响

流式细胞检测显示,5-ASA0、10、20mmol/L组间HT-29细胞G0/G1期细胞比例无明显差异(P>0.05),30、40mmol/L组G0/G1期细胞比例显著低于0、10、20mmol/L组,且40mmol/L组显著低于30mmol/L组(P<0.05)(表1),提示10~20mmol/L5-ASA对G0/G1期细胞比例无明显影响,而30~40mmol/L5-ASA可使G0/G1期细胞比例显著减少。5-ASA0、10、20、30mmol/L组间S期细胞比例无明显差异(P>0.05),但四组S期细胞比例均显著低于40mmol/L组(P<0.05)(表1),提示10~30mmol/L5-ASA对S期细胞比例无明显影响,而40mmol/L5-ASA可使S期细胞比例显著增加。5-ASA0、10、20mmol/L组间G2/M期细胞比例无明显差异(P>0.05),30、40mmol/L组G2/M期细胞比例显著高于0、10、20mmol/L组,且40mmol/L组显著高于30mmol/L组(P<0.05)(表1),提示10~20mmol/L5-ASA对G2/M期细胞比例无明显影响,而30~40mmol/L5-ASA可使G2/M期细胞比例显著增加。

四、5-ASA对HT-29细胞AuroraB表达的影响

免疫组化法检测结果显示,AuroraB阳性染色主要表达于细胞核,呈深棕色颗粒,细胞质和细胞膜则均无表达。5-ASA0、10、20、30、40mmol/L组AuroraBMOD值分别为0.78±0.03、0.55±0.03、0.53±0.04、0.47±0.03和0.36±0.02,随5-ASA浓度升高而降低,除10mmol/L组与20mmol/L组间外,各组间差异均有学意义(P<0.05)(图2)。

五、5-ASA对HT-29细胞BubR1表达的影响

免疫组化法检测结果显示,BubR1阳性染色主要表达于细胞质,呈棕黄色颗粒,细胞核中有少量表达。5-ASA0、10、20、30、40mmol/L组BubR1MOD值分别为0.31±0.01、0.26±0.02、0.26±0.01、0.24±0.02和0.22±0.01,随5-ASA浓度升高而降低,10、20、30、40mmol/L组间差异无学意义(P>0.05),但均显著低于0mmol/L组(P<0.05)(图3)。

六、5-ASA浓度与HT-29细胞增殖、凋亡以及AuroraB和BubR1蛋白表达的关系

Spearman相关分析显示,5-ASA浓度与HT-29细胞增殖抑制率(rs=0.91,P=0.00)、凋亡率(rs=0.89,P=0.00)呈正相关,与AuroraBMOD值(rs=-0.96,P=0.00)、BubR1MOD值(rs=-0.86,P=0.00)呈负相关。七、AuroraB、BubR1蛋白表达与HT-29细胞增殖、凋亡以及细胞周期的关系Pearson相关分析显示,AuroraB、BubR1MOD值与HT-29细胞增殖抑制率(r=-0.81,P=0.00;r=-0.70,P=0.00)、凋亡率(r=-0.93,P=0.00;r=-0.89,P=0.00)、G2/M期细胞比例(r=-0.76,P=0.00;r=-0.73,P=0.00)呈负相关,与G0/G1期细胞比例(r=0.75,P=0.00;r=0.74,P=0.00)呈正相关。AuroraB与BubR1MOD值呈正相关(r=0.894,P=0.00)。

七、讨论

5-ASA应用于炎症性肠病(IBD)的治疗至今已30余年,其不仅能有效控制结肠黏膜炎症,还能通过调控COX-2/PGE2、EGFR、NF-κB、Wnt/β-catenin信号通路、调节细胞周期相关蛋白表达、提高细胞复制的保真度等途径实现对UC癌变的化学预防效应[3]。5-ASA是治疗UC的基础药物,有口服和灌肠两种剂型,二者在临床上多联合应用。治疗UC时,5-ASA剂量为2~4g/d,当5-ASA剂量>1.2g/d时,可使UcCRC发生率降低[4]。5-ASA的结肠黏膜内浓度为其有效治疗浓度,而结肠腔内药物浓度可间接反映黏膜内浓度。每日服用2g5-ASA的UC缓解期患者,结肠腔内5-ASA浓度约为20mmol/L[5],其肠腔内浓度除与口服剂量有关外,尚与剂型相关。故本研究选择0、10、20、30、40mmol/L5-ASA,模拟UC患者口服5-ASA后的结肠腔内药物浓度,探讨该浓度5-ASA作用下人结肠癌细胞株HT-29的增殖、凋亡情况、细胞周期以及丝/苏氨酸蛋白激酶AuroraB、有丝分裂检查点蛋白BubR1的表达情况。本研究结果显示,5-ASA在0~40mmol/L范围内可浓度依赖性地抑制HT-29细胞增殖、促进细胞凋亡,推测可能与5-ASA通过增强磷酸化表皮生长因子受体靶磷酸酶(SH-PTP2)活性以介导EGFR脱磷酸化、阻断EGFR信号通路、激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、引起有丝分裂阻滞、诱导caspase依赖性细胞凋亡等因素有关[6-8]。目前,研究对5-ASA引起细胞周期阻滞的阶段尚存在争议。Reinacher-Schick等[8]的研究显示,5-ASA能浓度依赖性地调节细胞周期,使细胞周期阻滞于G2/M期。然而Stolfi等[9]的研究显示,5-ASA通过降低细胞周期蛋白CDC25A表达抑制结直肠癌细胞由S期向G2期转换,导致S期细胞积聚。本研究结果显示,HT-29细胞经较高浓度(≥30mmol/L)5-ASA作用后,G0/G1期细胞数量减少、S期和G2/M期细胞数量增加,即出现S期和G2/M期阻滞,提示G1/S期转换受阻、有丝分裂检查点等细胞周期卡点跨越异常;经10~20mmol/L5-ASA作用的HT-29细胞S期和G2/M期阻滞效应不明显,提示低浓度5-ASA对HT-29细胞的细胞周期几乎无影响,其对细胞增殖的抑制和促凋亡作用可能系通过COX-2/PGE2通路等其他途径完成。然而,本研究中5-ASA的作用时间仅为24h,因此不排除低浓度长时间作用下细胞周期可进一步发生改变,后期需研究药物浓度、作用时间双重因素对HT-29细胞周期的影响。AuroraB基因位于染色体17p13,其编码产物AuroraB蛋白主要表达于细胞核,具有丝/苏氨酸激酶活性,与着丝粒中心蛋白(INCENP)、borealin、survivin构成染色体载体复合物,参与染色体-微管连接、微管张力感知、姐妹染色体分离以及细胞质分裂等事件[10]。AuroraB的表达具有时间性和空间性,其出现于细胞周期S期,在有丝分裂中-晚期转换前存在于姐妹染色体着丝粒上,在有丝分裂晚期和末期存在于纺锤体中央区[11]。Nguyen等[12]的研究发现,上皮细胞中AuroraB高表达可促进四倍体产生增多,诱导上皮细胞肿瘤形成。Tuncel等[13]的研究显示,结直肠癌组织中AuroraB表达升高,其表达水平与淋巴结转移相关。Azzariti等[14]的研究显示,AuroraB抑制剂可使结肠癌细胞染色体数目明显增加,改变细胞周期,诱导细胞凋亡,具有抗肿瘤效应。本研究结果显示,HT-29细胞的AuroraB蛋白表达水平呈5-ASA浓度依赖性降低,尤以30、40mmol/L5-ASA组为著,伴5-ASA浓度依赖性细胞增殖抑制、凋亡增加和G2/M期细胞周期阻滞,提示较高浓度的5-ASA可通过某种途径降低AuroraB表达,干扰有丝分裂,从而发挥抗癌效应。5-ASA预防UcCRC的进程中是否存在类似效应,有待进一步研究。BubR1蛋白由有丝分裂检查点Mad基因家族Bub1b基因编码,位于染色体15q14~21,由23个外显子组成,启动子区有众多转录因子结合位点。BubR1在正常结肠上皮中仅表达于细胞质,但在结肠腺癌细胞中,除表达于细胞质外,在细胞核中亦有所表达,参与形成微管-着丝粒连接、与Bub1、Bub3、Mad2等蛋白形成有丝分裂检查点复合物、与p53相互作用参与修复细胞纺锤体损伤[15-16]。Wei等[17]的研究发现,BubR1表达缺失可加速胚胎细胞有丝分裂中晚期转换,使异倍体增加。Rao等[18]的研究显示,BubR1表达缺失可促进结肠肿瘤发生。然而本研究中,HT-29细胞经不同浓度5-ASA作用后,BubR1表达呈浓度依赖性降低,伴HT-29细胞增殖抑制、凋亡增加和G2/M期细胞周期阻滞。在人肿瘤细胞中,与其他有丝分裂检查点蛋白一样,BubR1出现基因突变的概率非常小,Tighe等[19]的研究显示异倍体结肠癌细胞的有丝分裂检查点无异常改变。等[20]认为,BubR1等组成的有丝分裂检查点异常改变并非细胞癌变的起始因素,而是通过促进原癌基因和抑癌基因突变引起细胞癌变。本研究中,HT-29细胞经5-ASA作用后阻滞于G2/M期,说明有丝分裂检查点功能正常,BubR1表达降低并未弱化有丝分裂检查点功能。本研究结果显示HT-29细胞的BubR1与AuroraB表达水平呈正相关,考虑与BubR1、Mad2、Bub1、Cenp-E等有丝分裂检查点蛋白募集至着丝粒需AuroraB活化有关,提示经5-ASA作用后,HT-29细胞AuroraB表达降低,导致其对BubR1的活化、募集减少。此外,BubR1启动子区含有Sp1、Nkx-2、CdxA、SRY、MyoD、Ik-2、HNF-3b、Staf、Oct-1、Nkx-2、v-Myb、AML-1a等诸多转录因子结合位点,故不排除其他通路参与5-ASA对BubR1的表达抑制。综上所述,本研究结果显示,在一定浓度范围内,5-ASA可以浓度依赖性的方式降低HT-29细胞的AuroraB和BubR1表达,伴G0/G1期细胞数量减少、G2/M期细胞数量增加、细胞增殖抑制、凋亡增加。由此可见,5-ASA可抑制HT-29细胞增殖并诱导凋亡,其机制可能与5-ASA抑制AuroraB、BubR1表达,继而影响细胞周期有关,这可能是5-ASA抑制UcCRC发生的作用机制之一。

作者:邓勇彬 王承党 单位:福建医科大学附属第一医院消化科 福建医科大学消化系病研究室

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